Spider-Man : New Generation suit les aventures de Miles Morales, un adolescent afro-américain et portoricain qui vit à Brooklyn et s'efforce de s'intégrer dans son nouveau collège à Manhattan. Mais la vie de Miles se complique quand il se fait mordre par une araignée radioactive et se découvre des super-pouvoirs : il est désormais capable d'empoisonner ses adversaires, de se camoufler, de coller littéralement aux murs et aux plafonds , son ouïe est démultipliée... Dans le même temps, le plus redoutable cerveau criminel de la ville, le Caïd, a mis au point un accélérateur de particules nucléaires capable d'ouvrir un portail sur d'autres univers. Son invention va provoquer l'arrivée de plusieurs autres versions de Spider-Man dans le monde de Miles, dont un Peter Parker plus âgé, Spider-Gwen, Spider-Man Noir, Spider-Cochon et Peni Parker, venue d'un dessin animé japonais.

Après avoir retrouvé Gwen Stacy, Spider-Man, le sympathique héros originaire de Brooklyn, est catapulté à travers le Multivers, où il rencontre une équipe de Spider-Héros chargée d'en protéger l'existence. Mais lorsque les héros s'opposent sur la façon de gérer une nouvelle menace, Miles se retrouve confronté à eux et doit redéfinir ce que signifie être un héros afin de sauver les personnes qu'il aime le plus.